基因敲除细胞（基因敲除细胞的相关问题）

基因敲除细胞(基因敲除资源网络细胞的相关问题)。

在研究基因功能时，基因敲除是实现基因功能缺失的重要调控途径。与传统的RNAi技术相比，基因敲除可以完全消除目标基因的表达，最终使其蛋白完全不表达或完全失去功能，这也让我们可以更好地观察细胞表型的变化。

但是，你可能对基因敲除细胞模型有很多疑问。赛野生物细胞生物学产品经理整理了一些关于基因敲除细胞模型的常见问题，并做了解答。看看你的问题是否已经在下面回答了。如果您有任何其他问题需要回答，请随时联系我们。

要实现Q1的基因功能缺失，应该做RNAi还是敲除？

答:

1)当敲除可能导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或细胞转染后细胞池阶段检测效率呈明显下降趋势时，可判断敲除可能导致死亡，而RNAi建议；

2)因为有一些功能很强的蛋白质，即使它们的表达下调，仍然有很强的功能。如果RNAi不能一直制造表型，从相关资料推测这个基因很可能制造表型，所以推荐KO。另外，如果目的基因位于非翻译区，或者目的基因转录效率高，不能被RNAi有效干扰，只能做KO，KO细胞更适合补充实验。

3)最后，击倒和击倒资源网络的关系不是两者之一。当我们用RNAi敲除基因，观察细胞表型变化时，仍然可以进一步敲除，使实验结论更有说服力。

Q2单克隆抗体和KO细胞池有什么区别？

答:

KO单克隆是指所有细胞都是从一个经测序验证的纯合细胞中繁殖而来，所有细胞的基因型都是同一个资源网络。ko细胞池是指未经单克隆和筛选的细胞池，因此可以理解，这组细胞包含KO纯合子、杂合子和野生型。得到KO细胞池后，我们必须根据后续实验的要求选择单克隆。

当需要去除细胞群体的干扰因素时，建议使用单克隆稳定细胞系，其基因组背景相对简单，对实验结果的干扰因素少。在研究系统生物学时，有必要考虑细胞群体因素。同时，由于不同细胞之间差异较大，单克隆细胞在不同整合位点的细胞行为可能不一致，因此许多实验使用混合克隆来更好地去除细胞间差异带来的干扰。因此，单克隆细胞株或混合克隆细胞株的选择需要根据实验目的来确定。

Q3移码突变和片段敲除哪个能更好地破坏靶蛋白的功能域？

答:

虽然主观上容易认为片段敲除对蛋白质功能域的影响更大，但实际上无论是移码还是片段敲除在很多情况下都能达到理想的敲除效果。

无论是片段敲除还是移码突变，都要考虑敲除片段是否是非3的倍数。也就是说，我们不仅要考虑敲除区域，还要考虑敲除区域是否能引起移码突变。如果敲除片段不能引起移码突变，蛋白质只缺少敲除区对应的氨基酸序列，而蛋白质的其他区域不受影响。

Q4能保证蛋白质不被表达吗？

答:

首先，保证蛋白质不被表达。从科学的角度来看，无论是移框突变还是片段敲除，任何细胞或基因都不可能保证蛋白质不表达。比如移码突变的mRNA可能发生可变剪切，直接跳过移码位点进行翻译，导致蛋白质表达；或者蛋白质表达功能域的位点正好在切割位点之前的区域，等等。

所以我们不会贸然说保证蛋白质不表达，这是违背科学原理的。但我们可以通过优化的gRNA设计，从根源上避免蛋白质残留的问题，在实验过程中结合抗体分析和阶段性WB测试，为您提供科学的解决方案，让您不再担心KO细胞中蛋白质残留的问题。

Q5如果要做KO的回复实验，应该如何设计方案？

答:

首先，需要做恢复实验的KO细胞的建立并不推荐稳定转移gRNA+移帧的策略。这是因为Cas9是连续表达的，而gRNA是一个作用于外显子的系统。恢复时，移框突变必须是cDNA突变，即同义突变，CRISPR识别的PAM序列将被去除，否则cDNA将被切断。另外，片段敲除是指在内含子上切割两个gRNA，切割位点在cDNA上不被识别，所以表达后进行恢复实验比较顺利。

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