lncrna引物设计（CRISPR/Cas9敲除LncRNA或者外显子的效率是多少？）
LNRNA引物设计(CRISPR/Cas9)敲除LNRNA或外显子的效率如何？)
经常有小伙伴问CRISPR/Cas9系统敲除整个外显子或lncRNA的效率有多高，是否与敲除片段的大小有关？为了回答这个问题，我想和大家分享一篇验证淘汰制效率的文章。
2014年在JBC发表了题为《哺乳动物细胞中簇状规则间隔回文重复(crispr)/cas9核系统介导的基因组缺失效率的表征》的文章，NCBI显示该文章已被引用154次。
为了研究CRISPR/Cas9介导的基因组片段敲除的效率，本文设计了一系列配对的sgRNA来敲除长度为1.3kb到1MB的基因组片段(图1)。这些片段有的位于外显子区，有的位于内含子区，有的位于基因间区。而且所有编辑过的基因都与细胞增殖无关。
图1。成对sgRNA靶标的设计
在配对的sgRNA设计中，虽然有可能敲除sgRNA的两个中间片段，但也可能在不缺失的情况下原位修复。为了检测特异性结果，作者在不同靶标附近设计了几对引物。
图2。用于维修结果分析的底漆设计
在开始检测该细胞是否存在等位基因敲除时，使用了图2中的两对蓝色和红色引物，红色引物位于两个sgrna之间，蓝色引物位于两个sgrna之外。这时，有三种情况。第一，如果红色引物PCR在DNA凝胶中没有条带，而蓝色引物PCR有条带(如果蓝色引物中段太长，无法扩增产物，PCR就无法扩增产物)，说明是纯合敲除。其次，如果红色引物PCR有条带，蓝色引物PCR也有条带，说明杂合子被敲除了。第三，如果红色引物PCR有条带，而蓝色引物PCR没有条带，说明没有发生敲除。
但对于带条带的红色引物PCR产物，还有另一种情况需要分析，即sgRNA的两个中间片段是否发生了反向。因此，作者在图2中设计了以下两对绿色和紫色引物来扩增sgRNA靶及其相邻序列。如果引物1和2以及引物3和4在PCR中有条带，则意味着没有反转；如果引物1和3以及引物2和4具有条带，这意味着中间片段是反向的。
图3。成对sgRNA切除基因片段的效率
从17对sgRNA中筛选出1974个克隆，最终检测出278株单克隆细胞系。根据等位基因分析，在278个细胞中有556个等位基因。19/556 (26.8%)个等位基因中间片段被删除，72/556(12.9%)个等位基因中间片段被逆转，其余60%在Cas9的切割位置被原位修复而未被删除。在做外显子敲除时，等位基因反转的情况也是可以考虑的一种基因编辑方法。总体来看，等位基因倒位加缺失的比例接近40%。然而，对于敲除lncRNA，由于不确定反转是否会使其功能失活，lncRNA不建议在后续实验中使用反转克隆。
根据细胞株分析，31/278(11.2%)的细胞为双等位基因缺失细胞，2/278(0.7%)的细胞为双等位基因倒位细胞。26/278(9.4%)细胞有一个等位基因缺失，一个等位基因逆转。在61/278(21.9%)的细胞中，一个等位基因被敲除，另一个等位基因在Cas9切割位点被原位修复。在39/278(14.1%)细胞中，一个等位基因被逆转，另一个等位基因在Cas9切割位点被原位修复，而两个等位基因既不缺失也不逆转的细胞比例为119/278(42.8%)(图3)。
综合所有数据后，本文进一步分析了敲除片段长度与敲除效率的关系(根据等位基因分析)，得出敲除效率与敲除长度负相关的结论(图4)。可以看出，当敲除片段小于23kb时，敲除效率基本在10%以上，甚至很多片段的敲除效率在20%甚至30%以上。
除了击倒效率的信息，文章中还有一些细节值得关注。首先，精确删除6/40(15%)双等位基因敲除细胞；27/87(31%)的单等位基因敲除细胞被精确敲除。此外，目前认为野生spCas9的切割位点位于靶标第17、18位的中间，切割产生平端。所谓精确敲除是指两个cas9的切割序列直接相连，中间不缺失或插入其他序列。其次，对于没有精确删除的细胞，由于两个平端通过NHEJ修复进行修复，经常会引入一些indes，这些indes的长度大多集中在-10bp-0bp(减号代表删除，加号代表插入)。第三，对于双等位基因敲除细胞，对其中部分细胞进行了第一代测序，发现22/31(71%)细胞的两个等位基因之间的indel序列相同，9/31(29%)细胞的两个等位基因的indel片段不同。
如果你把这里的第一点和第三点结合起来，你会发现一些有趣的NHEJ内容。例如，如此高的精确修复率表明，在NHEJ修复过程中很有可能不会引入indel。另一个例子是，高百分比的纯合子缺失(相同的indel)表明可能存在根据模板修复NHEJ的可能性。
注:低阳性率细胞筛选方法的优化
对于超过1MB(1000kb)的片段缺失，即染色体水平的基因组大片段缺失，本文筛选比例为4/339，略超过1%。还有其他文章筛选后基本都是1%。如果我们筛选单克隆细胞系，如此低的比例是一项非常大的工作。而且，1%并不意味着100个细胞中就一定会有一个被筛选出来。被各种游戏厂商骗过抽卡的同学可能更能理解什么是非酋长。所以这里给大家介绍一种方法，在有限稀释时可以用每孔5-10个细胞稀释，用流式细胞仪每孔接种5-10个细胞。当我们在这些孔中检测到阳性细胞后，我们可以用这个孔中的细胞选择单克隆抗体一次，第二次选择单克隆抗体的阳性率将直接上升到10%-20%。在两种情况下，我们推荐上述方法:第一，敲除片段大于1000kb其次，敲除片段小于1000kb，PCR验证有阳性细胞，但多次单克隆选择后未发现阳性克隆。
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