石蜡包埋（石蜡切片免疫组化）

石蜡包埋（石蜡切片免疫组化）石蜡包埋(石蜡切片免疫组织化学)

1.组织的收集、固定和保存:

在组织之后，

方法1:将4%多聚甲醛(4% PFA)在4℃固定1小时(固定时间根据组织的大小和密度进行调整)或过夜。

方法二:用布恩氏固定rt 2h(6-8d tesis)或rt过夜(成人tesis)

PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟，并储存在4℃的70%乙醇中

2.组织的包埋、切片、铺展和保存:

固定的样品用梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，包埋在52-54℃的石蜡中，常规切片，厚度为4-10毫米，粘在处理过的干净载玻片上，在37℃烘烤过夜，然后收集在载玻片盒中，并保持在室温密封中。

石蜡包埋:

组织样本储存在4℃70%乙醇中

80%乙醇15分钟

95%乙醇15分钟

100%乙醇，15分钟2次

1/2乙醇和1/2二甲苯，持续15分钟

二甲苯透明5-10分钟

1/2二甲苯1/2石蜡30分钟

石蜡(1)1.5小时

石蜡(2)1.5-2.5小时

石蜡包埋

实时保存

3.石蜡切片免疫组织化学方法:

在室温下密封的组织切片

二甲苯(1) 20分钟

二甲苯(2) 20分钟

100%乙醇20分钟

95%乙醇10分钟

80%乙醇10分钟

通风柜晾干，防水笔在纸巾周围画一个圈。

将切片在PBS中浸泡5分钟*2

0.4%Tritonx室温10分钟

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

3%H2O2室温10分钟

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

0.25%胰蛋白酶室温10分钟

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

阻断缓冲液(3%牛血清白蛋白+5% NGS+0.2%曲通-100 PBS)室温60分钟

去堵缓冲，不洗。

在封闭缓冲液中放置1个防4℃过夜

取出切片再加热1h，在PBS中浸泡5 min*3。

二抗阻断缓冲液gar 1: 200 (GAM 1: 100)，RT 1h

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

DAB显影时间为5-10分钟(50 μ l A+50 μ l B+900 μ l PBS+5 μ l 3%H2O2)

如果是增强DAB，只需要1分钟。

将切片浸入PBS中停止显色，并用he染色1秒。

将载玻片架放入泡沫盒中，用流水冲洗15分钟，当肉眼看到微弱的紫色时停止。

如果颜色太深，可以用0.1-0.5%的盐酸乙醇进行1-2秒(或更长)的分色。

将85%乙醇脱水5分钟

95%乙醇5分钟

无水乙醇5分钟

无水乙醇5分钟

二甲苯(1)十分钟

二甲苯(2)十分钟

中性胶密封，干燥，室温保存。

4.石蜡切片免疫荧光法；

在室温下密封的组织切片

二甲苯(1) 20分钟

二甲苯(2) 20分钟

100%乙醇20分钟

95%乙醇10分钟

80%乙醇10分钟

通风柜晾干，防水笔在纸巾周围画一个圈。

将切片在PBS中浸泡5分钟*2

0.4%Tritonx室温10分钟

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

0.25%胰蛋白酶室温10分钟

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

阻断缓冲液(3%牛血清白蛋白+5% NGS+0.2%曲通-100 PBS)室温60分钟

去堵缓冲，不洗。

在封闭缓冲液中放置1个防4℃过夜

取出切片再加热1h，在PBS中浸泡5 min*3。

阻断缓冲液中的二级荧光抗体gar-cy3 1: 1000，gam-488 1: 1000 rt 1h

DAPI (1: 1000，请按照第二抗体的说明稀释第二抗体)

将切片在PBS中浸泡5分钟*3

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