菌种保藏方法（微生物菌种保存方法汇总）

菌种保存方法(微生物菌种保存方法概述)

一、通行和保存方法

有些微生物经过冷冻或干燥处理后会很快死亡，所以在这种情况下，只能求助于继代培养和保存。继代培养是定期转移菌种，培养后保存。它是最基本的微生物保存方法，如酸奶等常用生产菌种的保存。继代培养时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度要尽量降低。培养温度通常略低于最适生长温度。如果是产酸菌株，应在培养基中加入少量碳酸钙。

一般大多数菌种的保存温度为5℃，厌氧菌、霍乱弧菌等微生物菌种和部分病原真菌可在37℃保存，而蘑菇等大型食用菌可直接在室温下保存。虽然传代保存的方法简单，但其缺点也很明显，如:

(1)应变管卫生棉条往往容易发霉；

②该菌株的遗传性状容易变异；

③反复传代后，菌株的致病性、形成生理活性物质的能力和形成孢子的能力下降。

④需要定期补种，工作量大；

⑤杂菌污染的机会很多。

二、液体石蜡覆盖保存法

与前一种方法相比，这种方法可以更长时间地保存菌株，适用于霉菌、酵母菌、放线菌和好氧菌的保存。这种方法可以通过限制氧气供应来防止干燥和削弱微生物代谢。这种方法具有简单方便的优点，也适用于不适合冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而一些细菌如固氮菌、乳杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌和沙门氏菌，以及一些真菌如根霉、草青霉、毛霉和根霉不适合用这种方法保存。

三、载体保存方法

即一种将微生物吸附在合适载体上进行干燥和保存的方法。常用的方法包括以下几种，如:

①土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保存。方法是在灭菌后的土壤中加入菌液，在室温下立即干燥或使细菌繁殖，然后干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。原则上，要保存的土壤应为肥沃的可耕地，土壤应风干、粉碎、过筛、灭菌。微生物在土壤中繁殖后干燥保存的方法是:取适量土壤(5g)，放入带棉塞的试管中，加水或充分稀释的液体培养基(含水量为土壤最大持水量的60%)，然后高压灭菌。接种大量待保存的微生物，培养至肉眼能确认菌丝，移入干燥器，短时间干燥或风干，密封，冷藏或室温保存。

②砂保存方法:取干净的砂，过筛除去大砂粒，用磁铁吸出砂中的铁屑，然后用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后放入试管或安瓿中保持2 ~ 3 cm深，然后干热灭菌，加入1mL菌种培养液，充分混合后放入真空空干燥器中。也可以将两部分水洗砂(用盐酸预处理)和一部分贫瘠过筛的黄土混合、灭菌后保存。

③硅胶保存方法:用6 ~ 16目无色硅胶代替沙子，干热灭菌，然后加入菌液。加入菌液时，由于硅胶的吸附热往往会升高温度，所以要尽量冷却。

④磁珠保存法:将菌液浸入烧结磁珠(或多孔玻璃珠)中后进行干燥保存的方法。用1/2管高硅胶(或无水硫酸钙)填充螺旋口腔试管，铺玻璃棉，然后放入10 ~ 20个磁珠，干热灭菌后，接种菌悬液，最后冷藏，室温保存或减压干燥，然后密封保存。这种方法对酵母特别是根瘤菌非常有效，可以保存长达两年半。

⑤麸皮保存方法:在麸皮中加入60%的水，灭菌后接种培养，最后干燥保存。

⑥纸(滤纸)的保存方法:将消毒后的纸浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥，放入装有干燥剂的容器中保存。

四.悬浮保存法

即使微生物悬浮在适当的溶液中。常用的方法有:

①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌和大多数放线菌，其菌体悬浮于蒸馏水中，可在室温下保存数年。这个规律要注意避免水分蒸发。

②糖液保存法:适用于酵母，如将其菌体悬浮于10%蔗糖溶液中，然后置于避光避光处保存，最长可保存10年。此外，缓冲溶液或盐溶液也可用于储存。

动词 （verb的缩写）宿主保存方法

也就是微生物入侵宿主后的保存方法。用于目前无法在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次体、螺旋体等。它们必须在活的动物、昆虫和鸡胚中被感染和传代。这种方法相当于一般微生物的传代培养和保存方法。病毒和其他微生物也可以通过其他方法保存，如液氮保存和冷冻干燥保存。

不及物动词冷冻保存方法

适用于抗冻性强的微生物。这些微生物可以在细胞外冷冻而不会受到损伤，而对于大多数其他微生物来说，在细胞外或细胞内冷冻会对细胞造成损伤。采用这种保存方法时，应注意以下几点:

(1)选择适合冷冻干燥的菌龄细胞。

②选择合适的培养基，因为随着培养基成分的变化，某些微生物的抗冻性往往表现出很大的差异。

③选择合适的菌种浓度，菌种浓度越高，成活率越高，保质期越长。

④最好不要添加电解质(如盐等)。)注入细菌溶液中。

⑤菌液中可加入甘油等保护剂，防止冷冻过程中大量细菌死亡的现象。同样，也可以加入各种保护效果好的溶剂，如糖、去纤维血、脱脂奶等，但对于某些微生物，不加保护剂效果更好。

⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但加入保护剂后，可静置一段时间再进行处理。

⑦就动物细胞而言，应在-20℃范围内，以1℃/min左右的速度缓慢降温，然后必须尽快降至保存温度；对于绝大多数微生物来说，这是没有必要的。例如，结构复杂的原生动物可以在-35℃范围内缓慢冷却，而噬菌体必须通过上述两阶段方法冷冻。

⑧如果长时间存放，存放温度越低越好。

⑨取冷冻菌种时，应采取快速融化措施，即在35 ~ 40℃的温水中轻轻摇晃，使其快速融化。就厌氧菌而言，应选择静置和融化的措施。冷冻的细菌融化时，要尽量避免再次冷冻，否则细菌的存活率会明显下降。

常用的冷冻保存方法包括:

①低温冰箱保存方法(-20℃、-50℃或-85℃):

冷冻保存时使用螺旋口试管方便，棉塞试管外还可包裹塑料薄膜。菌液在储存过程中用量不宜过多，有的可加入保护剂。另外，φ5mm的玻璃珠也可以用来吸附菌液，然后将玻璃珠放入塑料容器中，再放入低温冰箱保存。

②干冰保存法(-70℃左右):

即将菌种管插入干冰中，然后放入冰箱冷冻保存；

③液氮保存法(-196℃):

它是应用最广泛的微生物保存方法。

操作步骤如下:

A.装瓶管:用尽可能厚的细菌悬浮在含有适当防冻剂的灭菌溶液中(保存霉菌不需要防冻剂)，然后将此溶液分装于安瓿中0.2 ~ 1 ml，或直接接种于装有分散剂的安瓿中，或直接将菌丝体琼脂块悬浮于分散剂中。

B.熔封封封瓶管:如果直接储存在气态液氮(-150℃ ~-170℃)中，则不需要熔封。

C.检查安瓿管是否熔合良好:将熔合的安瓿管浸泡在4℃合适的颜料溶液中2 ~ 30分钟，然后观察颜料是否进入安瓿。

d、缓冷:将熔封好的封瓶管放入小罐中，然后用液氮以1℃/min左右的速度冷却至-25℃左右，或放入-20℃ ~-25℃的冰箱中缓慢冷却30 ~ 60 min。

e、快速冷却:最后浸入液氮中，快速冷却至-196℃。

七、冷冻干燥保存方法

原理是先冷冻微生物，然后减压升华除去水分。事实上，细菌去除大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，从而达到长期维持生命状态的目的。这种方法适用于大多数微生物种类(包括噬菌体和立克次体等)的保存。).冷冻干燥过程中，应注意以下问题:

a、冻干前培养条件:首先检查菌种纯度。一般来说，建议在营养丰富且易于富集的培养基上培养待保存的微生物。细菌年龄应达到对数生长期。如果是有孢子或孢子的微生物，最好在孢子和孢子形成后保存。菌液的浓度要高，如菌液应达到109 ~ 109~1010个/毫升。

B.菌株编号的标记等。:可以在安瓿外面做标记，也可以把标签封在安瓿里面。

c、安瓿的制备:将安瓿浸泡在2%HCl中过夜，用自来水冲洗3次，用蒸馏水刷洗，晾干，用棉塞塞住，贴上标签，干热灭菌或温灭菌后60℃烘干。

D.添加保护剂:常用的保护剂有脱脂奶、12%蔗糖、普通肉汤加7.5%葡萄糖、血清加7.5%葡萄糖等。甘油管保存法:在5mL菌种保存管中，将相同体积的菌悬液和40%甘油充分混合，然后放入-20℃的冰箱中保存。

八、甘油管保存法

在5ml菌种储存管中，将相同体积的菌悬液和40%甘油充分混合，储存在-20℃的冰箱中。

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